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高分文章和基金是如何用CRISPR/Cas9的?

师兄 小张聊科研 2019-06-30

国自然评审工作结束了,大家静待最终大结局吧,到时候那些没过的童鞋喝几顿酒抽几包烟之后,就可以为明年的国自然以及地方的基金申请开始构思了。

功能实验中分子的过表达、敲减等,最常用的是siRNA、shRNA等,其实新技术的运用也是备受评审专家的青睐的,siRNA和shRNA问题太多,脱靶效应严重,入细胞核困难,所以在新技术的应用上,不妨多花点钱、多花点精力,开始学习CRISPR/CAS9吧,其功能强大不说,例如knockin、knockout之外还有CRISPR/i、CRISPR/a,其可用于基因的功能Screen,晚学不如早学,反正迟早都得接触。

(一)国自然CRISPR这样用,眼前一亮

来看一下往年的CRISPR基金情况,按照2016年趋势,今年的CRISPR项目会突破80项?拭目以待吧。


看看2016年的几个国自然项目标题:

  1. WAS-iPSCs突变基因通过CRISPR/Cas9靶向修复并向造血细胞定向分化研究,235万;

  2. 基于光遗传学和CRISPR技术研究组蛋白乙酰化调控Fas表达水平在维持大肠癌干细胞特性中的作用及机制, 17万;

  3. CRISPR/Cas介导的GCPII及III基因联合剔除启动脑损伤后内源性神经保护的研究, 57万;

  4. CRISPR靶向导入SDF-1调控BMSCs促进眼眶骨再生及其机制探讨, 18万;

  5. 利用CRISPR技术探索Nrf2抗氧化通路在低氧诱导肺癌转移中的作用及机制, 18.5万;

  6. 基于CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术的成年小鼠肝癌模型建立,95万;

  7. CRISPR/Cas9介导的miRNA敲除诱导肺转移中处于休眠状态的肝癌细胞发生再激活的机制研究,17.5万

  8. CRISPR靶向调控HDAC9在骨髓基质干细胞治疗股骨头坏死的作用,51万;

  9. 基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除TRIM37泛素化连接酶基因治疗乳腺癌的实验研究, 20万;

  10. CRISPR/dCas9技术介导的联合基因修饰人羊膜上皮细胞治疗糖尿病ED的实验研究,60万;

  11. 利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE-/-小型猪动脉粥样硬化模型, 110万

  12. 通过CRISPR-Cas9介导建立可诱导的条件性敲除小鼠模型, 58万;

    。。。。。。

    Crispr技术的效率高准确度高的特点,使得项目更具创新性。


(二)拿到基金后,CRISPR可以这样玩

今天小编就给大家分享几篇CRISPR/Cas9的文章以及国自然基金,解剖麻雀,给人一种“这样做实验,想发低分都难”的感觉。

CRISPR应用多多,knockin、knockout、CRISPR/i(抑制)、CRISPR/a(激活),咱们一一讲解。

1. Knockin、knockout:基因敲入、敲除——研究非编码RNA

文章举例:Molecular Cell,IF=14

基因敲入敲除技术是CRISPR应用最广泛的一种应用了,基本原理都是比较类似的,张锋大神最开始的文章也是利用了Knockout技能。

这里分享一篇研究miRNA成熟影响因素的文章。  

这篇文章中主要是研究RNA结合蛋白RBP的作用,前期工作中作者筛选得到了大量的RBP可能调控特殊的miRNA成熟,那么作者利用CRISPR技术对RBP进行敲除,检测miRNA的成熟过程是否受到影响,例如作者发现C9ORF114蛋白可以结合在miRNA前体的发夹结构上,作者对C9ORF114进行敲除,操作如下:

根据基因C9ORF114的序列信息设计sgRNA构建转染载体pX330-gRNA(含Cas9)(Cas9既有识别功能又有DNA切割能力)lipo3000转染细胞Q-PCR、WB检测C9ORF114表达情况

2. RNAi沉默不掉lncRNA?Crispr/i可以!

文章举例:NUCLEIC ACIDS RES,IF=10

CRISPR可以实现在不改变基因组的情况下进行表观遗传水平的基因沉默。那为何不用基因敲除呢?

基因的deletion改变了DNA的组成,而siRNA和反义RNA介导的RNA水平沉默,都各有各的不足,而CRISPR/i提高了沉默的效率和精准度,也并没有改变DNA序列,一举两得。

这篇文章探讨的是用CRISPR/i技术表观抑制果蝇的lncRNA转录,从而进行表观遗传学上的调控,转录抑制的步骤如下:

根据基因roX1 和roX2的序列信息设计sgRNA构建转染载体pGTL-1(含dCas9)(dCas9只有识别功能丧失了DNA切割能力)转染果蝇和人细胞Q-PCR检测lncRNA表达情况

有效抑制了lncRNA的表达水平

 

3. lncRNA过表达的时间想自己说了算?试试Crispr/a!

文章举例:Nature Communications,IF=12

想瞬时过表达感兴趣的目的基因,不需要构建稳转细胞系,下面那可以尝试一下基于dCas9 SAM的激活系统。

这篇文章的研究主题是通过CRISPR/a文库筛选技术寻找可以正向调控AKT蛋白的lncRNA,看看作者如何做的。

PI3K/AKT是细胞信号转导中至关重要的信号通路(个性化信号通路不用愁),活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子,比如MDM2/p53, Foxo和NF-kB,进而调节细胞的增殖、转移、血管生成,目前只知道PI3K和PTEN可以调控AKT活性,lncRNA是否调控AKT未知。

本文应用张峰大神发明的CRISPR/Cas9 synergistic activation mediator (SAM),也即瞬时激活转录技术,作者筛选的步骤如下:

实验目的(筛选正向调控AKT的lncRNA)跟张锋索要CRISPR/lncRNA激活文库(5sgRNA/lncRNA)筛选原则确定(凡是能正向调控AKT的lncRNA的细胞株能存活)筛选机制(AKT高表达导致Foxo蛋白磷酸化后移位降解进而促进嘌呤霉素基因表达)嘌呤霉素(Puromycin)导致AKT低表达的细胞死亡,AKT高表达的细胞存活测序存活细胞,目标lncRNA信息获取。

如果张锋没空搭理你怎么办?那就去买商品化的文库吧。

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